光散射法白细胞计数和分类计数原理
(1)激光与细胞化学法
1)过氧化物酶检测通道:白细胞经过氧化物酶染色后,胞质内显示细胞化学反应,过氧化物酶活性:嗜酸性粒细胞>中性粒细胞>单核细胞,淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无过氧化物酶活性,此为血液分析仪白细胞分类的基础。当激光束照射到细胞时,产生不同强度的散射光,以吸光率(酶反应强度)为x轴,光散射(细胞大小)为Y轴,每个细胞根据这两个信号的不同,定位在散点图上。
2)嗜碱性粒细胞/分叶核检测通道:血液与酸性表面活性剂反应,不仅红细胞溶解,而且除嗜碱性粒细胞外,其他所有白细胞膜均被破坏。胞质溢出,仅剩裸核。当激光束照射到细胞时,产生不同强度的散射光,形成二维细胞图,其中,嗜碱性粒细胞呈高狭角散射,定位于细胞图上部,裸核细胞则位于细胞图下部。
(2)容量、电导、光散射(VCS)法
1)利用电阻抗法原理测量细胞体积(V)。
2)利用电导(c)技术测量细胞内部结构。原理是利用高频电磁探针测量细胞内部结构,根据细胞核和细胞质比例、细胞内颗粒大小和密度来识别体积相同、但性质不同的两类细胞群体,如小淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。
3)利用光散射(s)技术测量细胞形态和核结构。原理是利用激光照射进入计数区的每个细胞,根据散射光角度(10°~70°)的不同,提供每个细胞形态、核结构信息来鉴别中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
根据VCS原理,显示3种细胞散点图:DFl(体积和散射光)、DF2(体积和电导)、DF3(体积和电导,但只显示嗜碱性粒细胞群)。
(3)电阻抗与射频法
1)嗜酸性粒细胞检测系统:血液与嗜酸性粒细胞特异性溶血剂混合,使除嗜酸性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩,采用电阻抗法计数嗜酸性粒细胞。
2)嗜碱性粒细胞检测系统;血液与嗜碱性粒细胞特异性溶血剂混合,使除嗜碱性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩,采用电阻抗法计数嗜碱性粒细胞。
3)白细胞分类检测系统:采用电阻抗和射频(能透入细胞内,测量核大小、颗粒多少)法,以直流电(DC)为横坐标,以射频(RF)为纵坐标,根据这两个信号将细胞定位于二维细胞散射图上,因淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的大小、胞质量、胞质内颗粒大小和密度、细胞核形态和密度各不相同,从而进行分类。
4)幼稚细胞检测系统:根据幼稚细胞膜上脂质较成熟细胞少的特性进行检测。在细胞悬液中加入硫化氨基酸,幼稚细胞的结合量多于较成熟的细胞,而且,幼稚细胞对溶血剂有抵抗作用,当加入溶血剂后,成熟细胞被溶解,幼稚细胞不被破坏,从而提供幼稚细胞信息(IMI)。
(4)多角度偏振光散射(MAPSS)法:当激光束照射到单个细胞时,从4个角度测定散射光密度:0)0°:前角光散射(10~3.),可测定细胞大小;⑦l0°:狭角光散射(7°~ll°),可测定细胞内部结构特征;③90.:垂直光散射(70.~ll0.),可测定细胞核分叶情况;④90°:消偏振光散射(70°~ll0°),可将嗜酸性粒细胞和其他细胞区分出来。
2.光散射法红细胞检测原理以低角度前向光散射和高角度光散射同时测量l个红细胞。低角度(2°~3°)光散射能测量单个红细胞体积,高角度(5°~l5°)光散射能测量单个红细胞血红蛋白浓度,得出MCV、MCH、MCHC值,并显示红细胞散射图、单个红细胞体积和血红蛋白含量直方图。
3.光散射法血小板检测原理单个球形化血小板通过激光束照射后,高角度(5°~15°)光散射能测量细胞折射指数(RI),低角度(2°~3°)光散射能测量细胞大小。在二维散射图上得出血小板数量和相关参数。
4.网织红细胞计数原理
(1)利用新亚甲蓝使网织红细胞RNA着色,加入使红细胞内Hb溢出的试剂,使其成为"影细胞",然后采用VCS原理,得出网织红细胞数和相关参数。
(2)利用碱性槐黄0等荧光染料与网织红细胞内的RNA结合,以波长488nm氩氖激光束为激光源照射网织红细胞,得到前向散射光强度(细胞体积大,J9和荧光强度(胞质内RNA多少),形成二维显示散点图,得出网织红细胞数和相关参数。