摘要目的：观察不孕患者血清AsAb及其外周血细胞培养上清液中IFN-γ的水平变化，了解AsAb与IFN-γ的相关性，揭示AsAb，IFN-γ与不孕的关系及致病机理。方法：酶联免疫吸附法（EnzymelinkedImmunosorbentAssay，ELISA）测定了62例不孕患者及50例正常生育者血清AsAb，同时测定50例不孕患者与50例正常生育者外周血细胞培养上清液中γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）水平。结果：（1）不孕患者血清AsAb阳性率（29.03%）显著高于正常生育组（6.00%，P＜0.05＝；（2）外周血细胞培养上清液中IFN-γ水平，不孕组为（1.1000.459）μg/L，显著高于正常生育组（0.6070.052）μg/L（P＜0.001＝；（3）不孕患者外周血细胞培养上清液中IFN-γ水平，AsAb阳性组（1.3080.345）μg/L，显著高于AsAb阴性组（0.8360.265）μg/L（P＜0.001＝；（4）不孕患者血清AsAb水平与培养上清液中IFN-γ水平呈显著正相关（r=0.8126，P＜0.001＝。结论：（1）AsAb是与不孕有密切关系的重要免疫因素；（2）不孕患者体内IFN-γ水平明显高于正常生育组，提示患者体内细胞免疫功能状态异常增强，异常升高的IFN-γ可能通过影响机体生殖免疫功能而导致不孕；（3）不孕患者体内异常高水平的IFN-γ与AsAb的产生有着密切的关系。
1954年，Rmke发现抗精子抗体后，抗精子抗体成为研究生殖异常免疫因素的焦点，有关抗精子抗体的生殖免疫作用及生殖免疫病理机制有详尽的阐述。对于不孕中细胞介导的免疫反应（CellMed-iatedImmunity，CMI）的病理机制的研究及探讨鲜有报道。随着先进的生物化学技术与免疫技术的建立和应用，能够系统地研究生殖异常免疫机制中潜在的淋巴因子与单核因子的作用，即细胞介导的免疫作用。Marcus曾发现有关精子抗原CMI反应，提出这一免疫机制可能参与不孕的发生，随后Anderson与Hill在研究中发现细胞因子在习惯性流产及不孕的病理机制中起重要作用，这些有力地支持了病理的CMI参与生殖紊乱过程。导致不孕的因素很多，本研究为了针对性研究免疫因素的作用，筛选出的不孕对象已排除生理解剖，生理功能，染色体异常及感染因素造成的不孕。本研究应用ELISA法检测了这类不孕患者及正常生育女性血清中抗精子抗体（AsAb）及其血细胞培养上清液中γ-干扰素（IFN-γ）水平，探讨AsAb，IFN-γ在不孕中的机制及其相关性。
1材料与方法1.1研究对象1.1.1病例选择标准原发或继发不孕，不孕期超过2年。女方基础体温双相，黄体期不少于12d，连续3个周期B超监测，卵泡发育及排卵正常。女方生殖系统无感染史。女方妇科检查无器质性病变，子宫输卵管通液及造影正常。配偶体检及精液常规正常，夫妇染色体数目，核型及显带正常。
1.1.2正常对照组选择标准女方月经及生育史正常。女方妇科检查无器质性病变。女方生殖系统无感染症状。宫内节育器避孕。
1.1.3分组不孕组：62例，为婚后夫妻性生活正常，未避孕，2年或2年以上不孕史，其中原发不孕52例，继发不孕10例，年龄22～34岁，平均26.532.57岁，不孕史2～10年，平均6年。（2）正常对照组：50例，月经及生育史正常，生殖系统无器质性病变及感染症状，育龄女性，年龄22～35岁，平均26.33+2.44岁。
1.2方法1.2.1标本筛选的研究对象空腹肘静脉血4ml，取2ml待自然凝集后，3000r/min离心，取上层血清，-60℃贮存待测；另2ml经抗凝处理后，取0.5ml全血培养50h，3000r/min离心取上清液，-60℃贮存待测。
1.2.2仪器、试剂隔水式电热恒温培养箱；超低温冰箱；酶标仪；人γ-干扰素酶联检测试剂盒；抗精子抗体酶联免疫测定试剂盒；RPMI1640培养基。
1.2.3结果计算及判定（1）抗精子抗体：Σ960型酶标仪测光密度（OD）值，凡样品孔OD值＞阴性对照孔2倍，即为阳性，否则为阴性。（2）γ-干扰素：Σ960型酶标仪测OD值，从标准曲线上查待测标本γ-干扰素浓度值。
1.2.4统计学处理两样本率比较采用χ2检验，正态性检验，方差齐性检验，成组设计的两样本均数采用t检验，直线相关系数采用t检验。
2结果2.1不孕组AsAb的阳性率（29.03%）显著高于正常生育组（6%，P＜0.05，见表1）。
表1不孕组与正常生育组AsAb阳性率的比较Tab.1ComparisonofAsAbpositiveratebetweeninfertilityandnormalpregnantgroup
GroupnPositiveNegativepositiverate（％）
Infertility62184429.031）
Normalpregnant503476.00note：1）P＜0.05，comparedwithnormalpregnantgroup2.2不孕组外周血细胞培养上清液中IFN-γ的水平为（1.1000.459）μg/L，正常生育组外周血细胞培养上清液中IFN-γ的水平为（0.6070.052）μg/L，不孕组IFN-γ水平显著高于正常生育组IFN-γ水平（P＜0.001，）。
2.3不孕患者共50例进行外周血细胞培养，其中17例血清AsAb阳性，33例血清AsAb阴性，按血清AsAb阳性与否分为AsAb阳性组与AsAb阴性组。AsAb阳性组IFN-γ水平为（1.3080.345）μg/L，显著高于AsAb阴性组IFN-γ水平（0.8360.265）μg/L（P＜0.001）。
2.4不孕患者AsAb与IFN-γOD值的直线相关分析显示AsAb与IFN-γ之间为显著正相关（r=0.8126，P＜0.001）。
3讨论正常情况下，精子对母体是异物。每次接触精子都是一种免疫接种，但只有少数女性产生抗精子抗体（AsAb），因为精浆中的免疫抑制物及女性体内的免疫调节机制抑制对精子的免疫反应，若某个环节异常，如精浆中的免疫抑制物缺乏，精子等抗原物质进入母体血液系统及免疫细胞的异常激活，免疫调节紊乱等，可引起对精子抗原的免疫反应，产生AsAb，导致抗生殖作用。本研究中62例筛选的不孕女性，ELISA法测定血清中AsAb阳性率为29.03％，显著高于正常生育组血清AsAb阳性率6.00％（P＜0.05），这与1988年FumitakaSaji的检验结果是相符合的，说明AsAb是不孕症的重要免疫因素。在大量的动物试验及临床研究中，发现AsAb可以通过如下机制影响受孕。①AsAb可以使精子凝集，不能进入宫腔，并被补体和/或细胞介导的杀伤作用损害，失去活动力。②干扰精子获能抑制顶体反应。③阻止精子穿透卵透明带作用。④干扰精-卵粘附与融合。⑤早期胚胎上有精子抗原，AsAb可以通过介导补体，巨噬细胞和杀伤细胞直接杀伤受精卵和早期胚胎。总之，AsAb可以通过不同的环节影响生殖过程导致不孕，临床上对于不孕症，特别是生理解剖，生理功能及遗传因素均无异常的不孕患者，AsAb检测是必不可少的诊断手段。
1989年，Witkin等在研究68例不孕女性时，发现抗精子抗体阳性者40例，其中15例血清中含有异常升高的IFN-γ，而抗精子抗体阴性者中仅有两例含升高的IFN-γ，两组比较有显著差异性，因此提出IFN-γ作用可能是促进不孕的新机制。本研究发现不孕组培养上清液中AsAb阳性组中IFN-γ为（1.3080.345）μg/L，显著高于AsAb阴性组IFN-γ水平（0.8350.265）μg/L（P＜0.001），且不孕组培养上清液中IFN-γ水平为（1.1000.459）μg/L，显著高于正常生育组（0.6070.052）μg/L，血清抗精子抗体水平与培养上清中IFN-γ水平呈正相关关系（r=0.8126，P＜0.001），这个结果支持了Witkin的观点，同时与Anderson，Hill及Cunningham的研究结果一致：CMI反应是导致不孕的病理机制。本研究提示AsAb与IFN-γ之间相互影响，相互促进。由此推测：精子抗原易于激活AsAb阳性患者体内的淋巴细胞产生IFN-γ等细胞因子，一方面IFN-γ具有免疫调节功能，可以抑制抑制性T淋巴细胞（Ts）的免疫抑制功能，促进淋巴细胞对精子抗原的免疫反应产生抗精子抗体；另一方面IFN-γ是淋巴细胞的活化诱导剂，可以促进巨噬细胞对精子抗原的有效呈递及T辅助细胞（TH）对精子抗原的双识别，进而激活B淋巴细胞，产生AsAb，AsAb反过来又可以协同精子抗原刺激并激活免疫细胞产生IFN-γ，两者形成正反馈，最终的结果是加重对精子抗原的免疫病理反应而导致不孕。
人体内CD4+的辅助T细胞可分为Th1细胞与Th2细胞，Th1细胞分泌白介素-2（IL-2），IFN-γ，肿瘤坏死因子-β（TNF-β）和IL-12，而Th2细胞分泌IL-4，IL-5，IL-6和IL-10，两细胞亚群均可分泌的细胞因子有GM-CSF，TNF-α，IL-3等，Th1和Th2细胞通过各自分泌的细胞因子相互制约，它们之间的平衡决定着机体细胞免疫与体液免疫之间的平衡。大量的动物及临床研究表明：Th2细胞因子对于正常的妊娠是非常重要的，正常妊娠以Th2型反应为主。病理妊娠时，Th1型细胞因子过度表达，胚胎吸收率较高，最终可导致RSA，原发性不孕，妊高征等。本研究中不孕患者体内异常升高的IFN-γ提示不孕患者体内的细胞免疫功能处于活性增强状态，Th1/Th2的平衡偏离，Th1型细胞因子过度表达，母胎之间免疫排斥反应增强，最终导致不孕。
导致这种免疫功能异常的确切原因尚不清楚，Cunningham推测由于精子抗原或感染而进入体内的微生物抗原激活免疫活性细胞，使免疫调节紊乱，免疫系统处于高反应状态。本研究中10例继发不孕患者中有5例为人工流产后继发不孕，抗精子抗体均为阳性，且IFN-γ水平较高，提示人工流产术操作不当所造成的亚临床生殖系统感染可以促进机体对精子抗原的免疫反应。
在女性生殖道内的免疫细胞普遍存在，微生物抗原，生殖组织的自身及异体抗原能激活体液和细胞免疫反应，两者相互影响，彼此调节，在不孕中可以起协同作用，同时精子，受精卵及早期胚胎既可以由于针对精子及胚胎抗原的特异性免疫受损害，也可以成为针对其他抗原的细胞免疫的无辜受害者。在不孕的发生机制中，各种因素都不是独立的，是相互作用，相互影响的。因此，积极防治各种微生物感染及针对性的免疫调节是治疗的主要原则。
